用凱氏定氮法測定食品中蛋白質的含量
用凱氏定氮法測定食品中蛋白質的含量
測定食品中蛋白質的含量有很多種方法，最常見也最普遍的就是凱氏定氮法。本文我們就主要通過介紹凱氏定氮法的整個操作流程，來學習凱氏定氮法測定蛋白質的原理，以及掌握凱氏定氮法的操作技術。包括樣品消化、蒸餾、滴定和蛋白質含量的計算。
凱氏定氮法實驗原理：蛋白質是含氮的化合物。食品與濃硫酸和催化劑共同加熱消化，使蛋白質分解，產生的氨與硫酸結合生成硫酸銨，留在消化液中，然后加堿蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后，再用鹽酸標準溶液滴定，根據酸的消耗量來乘以蛋白質換算系數，即得蛋白質含量。因為食品中除蛋白質外，還含有其它含氮物質，所以此蛋白質稱為粗蛋白。粗蛋白也可直接用儀器測出，如粗蛋白測定儀，它有三種型號，分別為KDN-04A粗蛋白測定儀，KDN-04B粗蛋白測定儀，KDN-04C粗蛋白測定儀。KDN系列凱氏定氮儀主要測定種子、糧食、食品、乳制品、飲料、飼料、土壤及其他農副產品中氮的含量。
凱氏定氮法儀器與試劑：
（一）試劑
硫酸銅（CuSO4?5H20）、硫酸鉀、硫酸（密度為1.8419g/L）、硼酸溶液（20g/L）、氫氧化鈉溶液（400g/L）、0.01mol/L鹽酸標準滴定溶液、混合指示試劑：0.1%甲基紅乙溶液液1份，與0.1%溴甲酚綠乙醇溶液5份臨用時混合、黃豆粉。
（二）儀器
微量定氮蒸餾裝置
凱氏定氮法實驗步驟
1、樣品消化
稱取黃豆粉約0.3g（±0.001g），移入干燥的100mL凱氏燒瓶中，加入0.2g硫酸銅和6g硫酸鉀，稍搖勻后瓶口放一小漏斗，加入20mL濃硫酸，將瓶以450角斜支于有小孔的石棉網上，使用萬用電爐，在通風櫥中加熱消化，開始時用低溫加熱，待內容物全部炭化，泡沫停止后，再升高溫度保持微沸，消化至液體呈藍綠色澄清透明后，繼續加熱0.5h，取下放冷，小心加20mL水，放冷后，無損地轉移到100mL容量瓶中，加水定容至刻度，混勻備用，即為消化液。
試劑空白實驗：取與樣品消化相同的硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸，按以上同樣方法進行消化，冷卻，加水定容至100mL，得試劑空白消化液。
2、定氮裝置的檢查與洗滌
檢查微量定氮裝置是否裝好。在蒸氣發生瓶內裝水約三分之二，加甲基紅指示劑數滴及數毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入數粒玻璃珠（或沸石）以防止暴沸。
測定前定氮裝置如下法洗滌2~3次：從樣品進口入加水適量（約占反應管三分之一體積）通入蒸汽煮沸，產生的蒸汽沖洗冷凝管，數分鐘后關閉夾子a，使反應管中的廢液倒吸流到反應室外層，打開夾子b由橡皮管排出，如此數次，即可使用。
3、堿化蒸餾
量取硼酸試劑20mL于三角瓶中，加入混合指示劑2~3滴，并使冷凝管的下端插入硼酸液面下，在螺旋夾a關閉，螺旋夾b開啟的狀態下，準確吸取10.0mL樣品消化液，由小漏斗流入反應室，并以10mL蒸餾水洗滌進樣口流入反應室，棒狀玻塞塞緊。使10mL氫氧化鈉溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其緩緩流入反應室，用少量水沖洗立即將玻塞蓋堅，并加水于小玻杯以防漏氣，開啟螺旋夾a，關閉螺旋夾b，開始蒸餾。通入蒸汽蒸騰10min后，移動接收瓶，液面離開凝管下端，再蒸餾2min。然后用少量水沖洗冷凝管下端外部，取下三角瓶，準備滴定。
同時吸取10.0mL試劑空白消化液按上法蒸餾操作。
4、樣品滴定
以0.01mol/L鹽酸標準溶液滴定至灰色為終點。
5、數據記錄
項 目 第一次 第二次 第三次
樣品消化液（mL）
滴定消耗鹽酸標準溶液（mL）
消耗鹽酸標準溶液平均值（mL）
結果計算
式中 X——樣品蛋白質含量（g/100g）；
V1——樣品滴定消耗鹽酸標準溶液體積（mL）；
V2——空白滴定消耗鹽酸標準溶液體積（mL）；
c——鹽酸標準滴定溶液濃度（mol/L）；
0.0140 ——1.0mL鹽酸 標準滴定溶液相當的氮的質量（g）；
m——樣品的質量（g）；
F——氮換算為蛋白質的系數，一般食物為6.25；乳制品為6.38；面粉為5.70；
高梁為6.24；花生為5.46；米為5.95；大豆及其制品為5.71；肉與肉制品為
6.25；大麥、小米、燕麥、裸麥為5.83；芝麻、向日葵5.30。
計算結果保留三位有效數字。
注意事項及說明
1、本法也適用于半固體試樣以及液體樣品檢測。半固體試樣一般取樣范圍為2.00g~5.00g；液體樣品取樣10.0mL~25.0mL（約相當氮30mg~40mg）。若檢測液體樣品，結果以g/100mL表示。
2、消化時，若樣品含糖高或含脂及較多時，注意控制加熱溫度，以免大量泡沫噴出凱氏燒瓶，造成樣品損失。可加入少量辛醇或液體石蠟，或硅消泡劑減少泡沫產生。
3、消化時應注意旋轉凱氏燒瓶，將附在瓶壁上的碳粒沖下，對樣品徹底消化。若樣品不易消化至澄清透明，可將凱氏燒瓶中溶液冷卻，加入數滴過氧化氫后，再繼續加熱消化至完全。
4、硼酸吸收液的溫度不應超過40℃，否則氨吸收減弱，造成檢測結果偏低。可把接收瓶置于冷水浴中。
5、在重復性條件下獲得兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的10%。
